جستجو در مقالات منتشر شده


9 نتیجه برای کلونینگ

دکتر محمد حسین شاه حسینی، دکتر مسعود مردانی، زهرا حسینی، دکتر حمید رضا خرم خورشید، امیر عباس رحیمی، دکتر جلیل وند- یوسفی،
دوره 14، شماره 56 - ( 7-1385 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: مایکوپلاسما پنومونیه عامل گرفتاری‌های تنفسی مانند گلودرد، فارنژیت، رینیت، تراکئوبرونشیت و هم‌چنین مسئول بیش از بیست درصد موارد پنومونی‌های کسب شده از جامعه است. روش‌های متداول تشخیص مایکوپلاسما پنومونیه دارای محدودیت‌هایی است، بنابراین نیاز به به‌کارگیری روش‌های دقیق دیگر کاملاً احساس می‌گردد. روش‌های مولکولی، از جمله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) دارای پتانسیل زیادی جهت تشخیص دقیق و سریع این عامل بیماری‌زا بوده و در نتیجه می‌توانند امکان شروع هر چه سریع‌تر درمان آنتی‌بیوتیکی بیماری را فراهم نمایند. در این مطالعه سعی شده است روش کشت و PCR مقایسه شده و یک روش سریع و عملی PCR برای شناسایی مایکوپلاسما پنومونیه طراحی و بررسی شود. روش بررسی: بر روی نمونه‌های کلینیکی 100 بیمار که با شکایات تنفسی به بیمارستان مراجعه کرده بودند، کشت وPCR انجام شد. یک روش PCR حساس با استفاده از پرایمرهای P4A و P4B و هدف ژنی P1 cytadhesin ، طراحی و بر روی نمونه‌های سوآپ جمع‌آوری شده از بیماران به‌کار گرفته‌ شد. محصول PCR (bp 345) به‌وسیله‌ی روش PCR-Cloning در پلاسمید pTZ57R کلون گردید و جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفت. یافته‌ها: همه نمونه‌های کشت مثبت دارای نتیجه‌ی PCR مثبت هم بودند. در 33 نمونه‌ی دیگر که از نظر کشت منفی بودند آزمایش PCR مثبت بود، در نتیجه 43 نمونه از 100 نمونه (43درصد) دارای نتیجه‌ی مستقیم مثبت PCR بودند. حد شناسایی سنجش مولکولی حاضر در حد 10 ارگانیسم مایکوپلاسما پنومونیه ارزیابی شد. در عین حال با 11 نمونه مایکوپلاسمای مورد استفاده و همین‌طور 17 گونه‌ی باکتریایی دیگر مورد استفاده در آزمون ویژگی هیچ محصولی تکثیر نگردید. نتیجه‌گیری: این مطالعه دلالت بر این موضوع دارد که PCR یک روش حساس و قابل اعتماد برای تشخیص سریع مایکوپلاسما پنومونیه در نمونه‌های عفونت‌های تنفسی است. دکترای تخصصی بیوتکنولوژی (فرآورده‌های بیولوژیک)، استادیار دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهریار/شهر قدس * متخصص عفونی، استاد دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ** کارشناس ارشد میکروبیولوژی، مربی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهریار/ شهر قدس *** متخصص ژنتیک، استادیار دانشگاه علوم بهزیستی و توانبخشی **** کارشناس ارشد ژنتیک، مربی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهریار/ شهر قدس ***** دکترای تخصصی میکروبیولوژی، دانشیار دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج ******


دکتر سید لطیف موسوی، شهرام نظریان، جعفر امانی، دکتر رحیم سروری زنجانی،
دوره 15، شماره 58 - ( 1-1386 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: سم‌های عصبی کلستریدیوم آزادسازی نوروترانسمیترها را به‌وسیله‌ی پروتئولیز اختصاصی و انتخابی SNAP-25 ، سیناپتوبروین VAMP و سینتاکسین، مهار می‌کنند. پروتئین SNAP-25 یکی از پروتئین‌های تشکیل‌دهنده‌ی مجموعه‌ی لنگراندازی (Docking complex) در پایانه‌های عصبی است. این پروتئین سوبسترای سم عصبی بوتولینوم، سروتیپ های A ،C و E می‌باشد. هر کدام از این سروتیپ‌ها به طور اختصاصی و در جایگاه ویژه SNAP-25 را در یک پیوند آمیدی برش داده و از تشکیل مجموعه‌ی لنگراندازی و در نهایت اگزوسیتوز نورترانسمیترها و انتقال پیام عصبی جلوگیری می‌کنند. در آزمایشگاه می‌توان با تولید SNAP-25 به روش نوترکیب از آن به عنوان سوبسترای سم، در تشخیص تیپ‌های E وA سم بوتولیسم بهره برد. روش بررسی: در این مطالعه بر آن شدیم که این پروتئین را به صورت نوترکیب تولید کنیم. برای این منظور cDNA ژن مورد نظر با استفاده از روش از RNA تام استخراج شده از سلول‌های مغز موش صحرایی تهیه و توسط RT-PCR تکثیر شد. محصول PCR روی ناقل pET32a همسانه‌سازی شد و پروتئین نوترکیب بیان شده به کمک روش وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی مورد تأیید قرار گرفت و در نهایت با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی (Ni-NTA) تخلیص و با کمک آنزیم اینتروکیناز فیوژن از پروتئین مورد نظر جدا شد. یافته‌ها: در این تحقیق شرایط بهینه برای بیان پروتئین نوترکیب SNAP-25 ، استفاده از غلظت یک میلی‌مولار IPTG ، مدت زمان انکوباسیون 5 ساعت در دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد تعیین شد. در تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون Ni-NTA ، غلظت 250 میلی‌مولار ایمیدازول باعث جداسازی و تخلیص پروتئین نوترکیب شد. هم‌چنین استفاده از آنزیم اینتروکیناز برای برش فیوژن در دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد نسبت به دمای محیط نتایج بهتری را به همراه داشت. نتیجه‌گیری: پروتئین نوترکیب تخلیص شده ساختار خود را در حین تخلیص از دست نداده و جهت برش و انجام آزمایشات بعدی مناسب و قابل استفاده می‌باشد. از آن‌جا که سایر روش‌های تشخیصی سم بوتولیسم از جمله روش استاندارد تزریق به موش بسیار وقت‌گیر می‌باشند لذا استفاده از این محصول نوترکیب به عنوان سوبسترا جهت تشخیص سم در آزمایشگاه می‌تواند تا اندازه‌ای مشکلات موجود در روش‌های قبلی را مرتفع سازد.


دکتر عبدالحسن کاظمی، دکتر جفری رابسون، دکتر دیوید دنینگ،
دوره 15، شماره 60 - ( 3-1386 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: فسفولیپاز‌های ترشحی خارج سلولی عموما در هیدرولیز فسفولیپید‌های خارج سلولی و در نتیجه، تهیه‌ی منابع تغذیه‌ای کربن، نیتروژن و فسفات برای سلول دخالت داشته ولی فسفولیپازهای درون‌سلولی در کنترل اعمال متابولیکی سلول مؤثر بوده و نقش تنظیمی برای فعالیت بیولوژیکی سلول برعهده دارند. تولید فسفولیپاز‌ها در میکروارگانیسم‌های مختلف بیماری‌زا و مکانیسم اثر آن‌ها در بیماری‌زایی این میکروارگانیسم‌ها اخیرا مورد توجه بسیار گسترده‌ای قرار‌گرفته است. روش‌بررسی: در این پژوهش، DNA ژنومی کپک آسپرژیلوس‌فومیگاتوس استخراج گردیده و متعاقب تکثیر قطعه‌ی مورد‌ نظر با تکنیک PCR دژنراتیو از DNA ژنومی میکروارگانیسم‌، قطعه‌ی استخراج شده بهpGEMT-Easy vector پیوند زده شده و سپس به سلول میزبان (E.coli Top 10 F') جهت انجام مراحل بعدی برای شناسایی توالی ژن فسفولیپاز D منتقل گردید. یافته‌ها: سکوانس نوکلئوتیدی ژن pld1 کپک آسپرژیلوس فومیگاتوس به طول 550 نوکلئوتید به ‌دست آمد که همسانی بسیار بالایی با توالی نوکلئوتیدهای ژن مشابه در سایر میکروارگانیسم‌ها را نشان می‌دهد. نتیجه‌گیری: مطالعات مربوط به تعیین سکوانس ژن‌ها عمدتا با هدف تعیین میزان مشارکت بیان ژن در بیماری‌زایی میکروارگانیسم؛ تعیین خصوصیات بیوشیمیایی و عملکرد فیزیولوژیک محصول ژن برای استنباط اطلاعات پایه جهت ارایه‌ی شیوه‌ی مصونیت‌بخشی، تهیه‌ی واکسن، دارو یا بلوکر برای محصول ژن و استفاده از محصول ژن به ‌عنوان شاخص تشخیص عفونت صورت می‌گیرد و کلونینگ بخشی از ژن فسفولیپاز D به منظور شناسایی توالی کامل نوکلئوتیدهای این ژن برای رسیدن به اهداف فوق مؤثر خواهد بود.


بهرام امینی، دکتر مهدی کمالی، دکتر علی زارعی محمودآبادی، دکتر یوسف مرتضوی، دکتر آزاده ابراهیم حبیبی، ابراهیم بیات، نیما فرهادی، حمیدرضا جوادی، امیر همایون کیهان،
دوره 18، شماره 71 - ( 3-1389 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: آنتی بادی بر علیه اگزوتوکسین A سودوموناس آیروژینوزا می‌تواند در ایمونوتراپی همراه با درمان آنتی بیوتیکی در بیماران دچار سوختگی شدید استفاده گردد. اگزوتوکسین A یکی از فاکتورهای بیماریزای سودوموناس آیروژینوزا است که از سه جایگاه اتصال دهنده، انتقال دهنده و کاتالیتیک تشکیل شده است. هدف از این مطالعه تولید نوترکیب جایگاه کاتالیتیک اگزوتوکسین A این میکرواورگانیسم، جهت تولید آنتی‌بادی بر علیه آن می‌باشد. روش بررسی: نمونه‌های سودوموناس آیروژینوزا از بیماران دچار سوختگی نوع دو و سه بستری در بیمارستان آیت الله موسوی زنجان، جدا و با روش‌های کشت و انجام آزمایشات بیوشیمیایی شناسایی گردید. DNA باکتری استخراج و وجود ژن اگزوتوکسین A روی کروموزوم باکتری از طریق PCR تایید گردید. جایگاه کاتالیتیک اگزوتوکسین A توسط PCR تکثیر و محصول PCR و پلاسمید توسط آنزیم‌های برش دهنده محدودالاثر، برش داده شدند. محصول PCR و پلاسمید پس از الحاق به باکتری میزبان E. coli BL21(DE3) تراریخت گردید. کلون‌ها با واکنش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی غربالگری و تایید گردیدند. یافته‌ها: توالی‌ بازهای منطقه‌ی کاتالیتیک اگزوتوکسین A با اطلاعات بانک ژنی مقایسه و میزان تشابه آن‌ها ارزیابی گردید. نتایج بیانگر عدم وجود تغییر در ژنوم آن در سوش‌های مورد مطالعه در کشور بود. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که حدود 90 درصد باکتری‌های جدا شده دارای سم اگزوتوکسین A بودند. و سوش‌های جدا شده از ایران با توالی‌های گزارش شده در بانک ژن مشابه بودند.


فریده دکتر زاده، دکتر اشرف محبتی مبارز، دکتر مهریار حبیبی رود کنار، دکتر مهدی فروزنده مقدم،
دوره 20، شماره 80 - ( 5-1391 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: پسودوموناس آئروژینوزا یک باکتری بیماری‌زای فرصت طلب است. این باکتری عفونت‌های شدید و کشنده در افرادی که ایمنی سرکوب شده دارند، ایجاد می‌کند. باکتری دارای یک فلاژل قطبی است. فلاژل و فلاژلین، زیر واحد ساختاری فلاژل، نقش مهمی در بیماری‌زایی پسودوموناس آئروژینوزا بازی می‌کند. فلاژلین از راه میانکنش دومین‌های انتهای آمینی خود با TLR-5، پاسخ‌های ایمنی را بر می‌انگیزد. هدف ما در این مطالعه کلونینگ و بیان انتهای آمینی فلاژلین پسودوموناس آئروژینوزا و ارزیابی آنتی‌بادی‌های تولید شده بر علیه آن در مهار حرکت پسودوموناس آئروژینوزا بود. روش بررسی: ناحیه‌ی کد کننده‌ی اسید آمینه‌های 1-161 فلاژلین با PCR تکثیر و در وکتور pET28a کلون شد. پروتئین نوترکیب در میزبان بیانی BL21(DE3) بیان و با استفاده از ستون Ni2+-NTA خالص گردید. واکنش ایمنی پروتئین نوترکیب با آزمون وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین انتهای آمینی فلاژلین به خرگوش تزریق و از آنتی سرم تولید شده در بدن خرگوش برای مهار حرکت پسودوموناس آئروژینوزا M8821 استفاده شد. یافته‌ها: انتهای آمینی فلاژلین به خوبی در میزبان بیانی اشریشیاکلی BL21(DE3) بیان شد. آنتی‌بادی‌های ضد فلاژلین و انتهای آمینی فلاژلین با پروتئین نوترکیب واکنش نشان دادند. آزمون مهار حرکت باکتری ثابت کرد که آنتی بادی‌های پلی کلونال برعلیه انتهای آمینی فلاژلین قادرند حرکت پسودوموناس آئروژینوزا M8821 را مهار کنند. نتیجه‌گیری: دومین‌های انتهای آمینی فلاژلین ممکن است در طراحی واکسن‌های نوترکیب بر علیه عفونت‌های پسودوموناس آئروژینوزا مورد استفاده قرار گیرند. واژگان کلیدی: انتهای آمینی فلاژلین، پسودوموناس آئروژینوزا، کلونینگ، مهار حرکت


محمدعلی حقیقی، دکتر اشرف محبتی مبارز، دکتر هاتف علی سلیمانیان، دکتر محمد رضا زالی، دکتر سید محمد موذنی، دکتر علی اصغر کارخانه،
دوره 21، شماره 85 - ( 2-1392 )
چکیده

چکیده زمینه و هدف: پروتیین فعال کننده‌ی نوتروفیل درهلیکوباکترپیلوری (HP-NAP) از مهم‌ترین فاکتورهای بیماری‌زای این باکتری است که از اهمیت به‌سزایی در ایجاد ایمنی حفاظتی برعلیه این پاتوژن برخوردار است. این آنتی ژن کاندیدای بسیار مطرحی به‌عنوان بخشی از واکسن‌های چند قسمتی برعلیه این باکتری در مطالعات کلینیکی می‌باشد. به‌دلیل اهمیت پروتیین HP-NAP، در این مطالعه از آن به‌عنوان الگویی برای بهینه کردن ژن‌های هترولوگ که محتوای تیمین و آدنین بالا و میزان بیان پایینی در باکتری اشریشیاکلی دارند، استفاده شد. روش بررسی: با کاربرد علوم بیوانفورماتیک ژن کد کننده‌ی این پروتیین برای بیان حداکثری در میزبان مربوطه بهینه و سپس ساخته شد. یافته‌ها: در بهینه کردن ژن HP-NAP عوامل مختلفی تغییر داده شد. کدن‌ها به کدن‌های رایج در باکتری اشریشیا کلی تغییر کرد، محتوای G+C از 38 درصد به 45 درصد افزایش یافت و ساختارهای فضایی نامناسب در ساختمان دوم mRNA شکسته شد، این تغییرات منجر به طولانی شدن نیمه عمر mRNA و افزایش قابل ملاحظه‌ی بیان پروتیین نوترکیب HP-NAP به‌میزان حداقل 800 میلی‌گرم در لیتر گردید. نتیجه‌گیری: کاربرد ابزار بیوانفورماتیک در افزایش و بهینه‌سازی بیان پروتیین HP-NAPدر باکتری اشریشیا کلی موفق بود. با توجه به نتایج این مطالعه به نظر می‌رسد کاربرد این ابزارها روشی منطقی در بهینه کردن ژن‌هایی با منشا متفاوت جهت بیان در میزبان‌های بیانی دیگر باشد.


وحیده احمد‌زاده، دکتر صفر فرج‌نیا، دکتر محمد‌علی حسینپور فیضی، دکتر رمضانعلی خاوری نژاد،
دوره 21، شماره 88 - ( 5-1392 )
چکیده

زمینه و هدف: رتوکسی‌مب (Rituximab) آنتی‌بادی مونوکلونال کایمریک بر ضد آنتی ژن CD20 بوده، به‌طور گسترده برای درمان لنفومای سلول‌های B استفاده می‌گردد. با این وجود سایز بزرگ و ایمنی‌زایی آنتی‌بادی‌های کامل موشی همواره به عنوان مشکل در ایمونوتراپی مطرح بوده است. جهت حل این مشکل می‌توان از قطعات کوچک آنتی‌بادی انسانی شده استفاده نمود. هدف از این تحقیق تولید آنتی‌بادی تک زنجیره‌ای انسانی به منظور کاربرد آن در درمان ناهنجاری‌های مرتبط با سلول‌های B است. روش بررسی: به منظور طراحی آنتی بادی Rituximab انسانی شده با استفاده از روش CDR-grafting، نواحی CDR موشی به قسمت‌های Framework ایمونوگلوبولین‌های Germline انسانی منتخب دارای بیشترین شباهت با همتای موشی پیوند شدند. توالی نوکلئوتیدی طراحی شده درE.coli بیان شده، سپس تخلیص گردید. میزان بیان آنتی‌بادی نوترکیب با SDS-PAGE و واکنش آن با رده‌ی سلولی Raji با استفاده از تکنیک Dot blot مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته‌ها: در انتخاب نواحی Framework انسانی به‌منظور CDR Graftingایمونوگلوبولین‌های IGHV1-46*03و IGKV1-39*01 بیشترین شباهت را با آنتی بادی اولیه نشان دادند. بررسی بیان با روش SDS-PAGE مشخص کرد آنتی بادی تولیدی با غلظت بالا در E.coli بیان گردیده، با افینیتی مناسب نسبت به آنتی ژن CD20 بیان شده در سطح سلول‌های Raji واکنش نشان داد. نتیجه‌گیری: آنتی‌بادی تک زنجیره‌ای انسانی تولید شده می‌تواند به مارکر CD20 متصل گردیده، به‌عنوان روش درمانی برای هدف قرار دادن این آنتی ژن در درمان سرطان‌های مرتبط به کار رود.
نرگس خازه، دکتر محمد پاژنگ، دکتر فرامرز مهرنژاد، دکتر نادر چاپارزاده،
دوره 23، شماره 100 - ( 5-1394 )
چکیده

زمینه و هدف: گرانزیم M یکی از اعضای خانواده‌ی سرین پروتئازهاست که درلنفوسیت‌های T سیتوتوکسیک و سلول‌های NK بیان می‌شود. گرانزیم M یک القاکننده‌ی آپوپتوز در سلول‌های توموری هدف می‌باشد. بنابراین با توجه به اهمیت گرانزیم M در آپوپتوز، هدف از این تحقیق تولید آنزیم فعال به لحاظ زیستی می باشد . روش بررسی: قطعهcDNA مربوط به گرانزیم M فعال به درون ناقل بیانی pET21a(+) کلون و ناقل نوترکیب جهت بیان پروتئین، به سلول‌های مستعد با روش شوک حرارتی منتقل گردید. جهت بیان بالای پروتئین، شرایط القا بهینه گردید و سپس آنالیز پروتئین توسط SDS-PAGE انجام گرفت. سپس انکلوژن‌بادی‌های تولیدی در بافر حاوی اوره 8 مولار حل شده و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-آگارز خالص شد. فعالیت پروتئازی گرانزیم M با استفاده از سوبسترای کازئین و با روش اسپکتروفتومتری (طیف سنجی) سنجیده شد. یافته‌ها: گرانزیم M نوترکیب در باکتری E. coli به‌صورت انکلوژن‌بادی تولید شد و بهترین سطح بیان در دمای 22 درجه‌ی با غلظت 1 میلی‌مولار از IPTG در طول 5 ساعت است. با استفاده از ستون نیکل- آگارز و شیب غلظت اوره، گرانزیم M به‌طور همزمان با تاخوردن، خالص گردید. نتایج حاصل از تعیین فعالیت نشان داد که آنزیم در حضور سوبسترای کازئین فعال بوده و فعالیت ویژه‌اش 71 واحد بر میلی‌گرم است. فعال بودن گرانزیم M نشان دهنده‌ی این بود که آنزیم تاخوردگی درستی پیدا کرده است. نتیجه‌گیری: با توجه با اینکه گرانزیم M می‌تواند هدفی بالقوه برای داروهای ضد سرطان باشد، بنابراین روش پیشنهادی در این تحقیق می‌تواند تسهیل کننده مطالعه بیشتر بر روی این آنزیم باشد.


دکتر مهدی ایمانی، دکتر محمد پاژنگ، سمیه میرزائی‌نیا،
دوره 24، شماره 106 - ( 5-1395 )
چکیده

زمینه و هدف: اوریکاز (EC 1.7.3.3) آنزیمی است که باعث کاتالیز اوریک اسید به H2O2 و الانتوئین می‌شود و در درمان نقرس استفاده می‌شود. هدف این تحقیق کلون‌سازی ژن سنتتیک کدکننده‌ی آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاوس در پلاسمید pET-28a(+) و بیان نوترکیب آن در اشریشیاکلی می‌باشد.

روش بررسی: بعد از استخراج توالی ژنی از پایگاه داده‌ها، ژن کدکننده‌ی اوریکاز بهینه سازی شد و سنتز آن سفارش داده شد. سپس ژن سنتتیک در پلاسمید pET-28a(+) در بین آنزیم‌های NcoI و XhoI ساب-کلون شد و توسط روش‌های هضم آنزیمی، PCR و تعیین توالی کلون‌سازی صحیح آن تایید شد. بعد از انتقال آن به باکتری Bl21 به روش شیمیایی والقا آن توسط IPTG، بیان آن بهینه‌سازی شد. برای ارزیابی القا آنزیم نوترکیب، ژل الکتروفورز پروتئین استفاده شد.

یافته‌ها: نتایج حاصل از هضم آنزیمی، PCR و تعیین توالی نشان داد که آنزیم اوریکاز به‌طور صحیح در جایگاه مورد نظر کلون‌سازی شده است. دمای 22 درجه‌ی سانتی‌گراد و زمان 6 ساعت با غلظت IPTG 1 میلی‌مول برای بهینه‌سازی بیان آنزیم به‌دست آمد. نتایج الکتروفورز آنزیم نوترکیب، جرم مولکولی 5/34 کیلودالتون را برای آنزیم بیان شده نشان داد. تعیین فعالیت آنزیمی مشخص کرد که فعالیت ویژه‌ی آنزیم اوریکاز 69/7 واحد بر میلی‌گرم است و آنزیم به لحاظ عملکردی فعال است.

نتیجه‌گیری: نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ژن اوریکاز را می‌توان به آسانی در سیستم بیانی pET کلون و بیان کرد. نتایج تعیین فعالیت ویژه مشخص کرد که پروتئین آنزیمی به‌صورت محلول در سیتوزول اشریشیا کلی تولید شده است و از نظر کاتالیتیکی فعال است.



صفحه 1 از 1     

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی زنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2019 All Rights Reserved | ZUMS Journal

Designed & Developed by : Yektaweb